CRISPR后起之秀,维生素D为什么这么多功能

维生素D越来越多的功能像谜一样困扰着研究人员,但研究它的分子机理并非易事。科学家们找到了结合激素调节蛋白的增强子区域,用CRISPR技术删除它,在小鼠中区分了两种不同的途径。这为维生素D相关疾病的综合治疗打开一道大门。

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最开始大家都以为是“垃圾”DNA的基因组“暗物质”近年来备受关注,增强子就是其中之一,来自加州大学旧金山分校的一组研究人员修改了现有的基因编辑CRISPR技术,用以来寻找增强子,他们的方法并不是编辑增强子,而是利用一种称为CRISPRa的工具,搜寻影响T细胞免疫细胞发育的一种基因的增强子。

人们熟知维生素D是骨骼生长所必需。而最近的研究进展发现它与抗衰老、抗炎症、抗肿瘤以及神经系统的健康发育都挂上了钩。但对于补充维生素D能否真的预防感冒?人们是否真正缺乏维生素D?等方面都存在着争论。这是由于维生素D在体内的活性成分如何起作用的分子机理还未被完全了解。之前的功能研究大多是从流行病学的角度做的相关性研究。

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1维生素D的活性成分在体内分两条途径起作用

非活性的维生素D从饮食中获得或可以由皮肤产生。然后在肾脏中转化为其活性形式——骨化三醇。骨化三醇也可以在身体的其他部位,包括皮肤细胞和免疫细胞中被转化。但在这些非肾脏部位,骨化三醇似乎起着一个完全不同的目的:它在调节矿物质中不发挥作用,它的产生是由炎症诱导的,而不是像在肾脏中由骨化三醇合成激素控制的。

我们人体每个细胞的基因组中都有大致相同的22,000个基因,但每个细胞采用的都是这些基因的不同组合,根据不同的需求开启或关闭某个基因。就是这些基因的表达以及抑制模式决定了细胞会成为什么细胞,是肾脏细胞,脑细胞,皮肤细胞,还是心脏细胞。

2CRISPR技术生产的小鼠可区分这两个途径

生物医学研究人员对理解非肾脏区域骨化三醇的产生以及和炎症性疾病的联系,包括多发性硬化症、关节炎等,有着极大的兴趣。他们想知道维生素D是否有可能被用于治疗这些疾病。然而,由于不能单独区分开肾脏和非肾脏区域维生素D激活的途径,这方面的研究一直受到阻碍。

美国威斯康星大学由J. Wesley Pike领导的一个研究小组,现在已经克服了这个障碍,利用CRISPR / CAS技术生产的小鼠可以对其肾脏的维生素D活化进行特异性控制。相关研究结果已在Journal of Biological Chemistry网站上在线发表,将于10月20日正式出版。

第一作者Mark Meyer说:“通过创造这些小鼠,我们可以只在肾脏中关闭内分泌调节生产骨化三醇。这样做,我们可以专注于研究骨化三醇的炎症调控。”

要想操控这些转换模式,我们的基因中就必须有调节序列,比如“增强子”,这种序列可能会离它所调控的基因十万八千里,但是在有信号输入的时候,就会激活基因,令其大量表达。也就是说增强子就像一个基因的说明书,决定着何时何地打开一个基因。

3研究人员找到了相关增强子的区域

生产骨化三醇的酶是CYP27B1,但在实验小鼠中,研究团队删除的基因组区域远离编码这种酶的基因。研究者删除的是CYP27B1基因增强子区域。这些区域的DNA和参与维生素D激素控制调节的特定蛋白质相结合,通过导致基因组DNA重排的方式提高CYP27B1的生产。

重要的是,删除这个区域就能杜绝CYP27B1被激素调控,但不影响与炎症相关的分子激活CYP27B1。这个区域是允许研究人员分别研究两种诱导途径生产骨化三醇的关键。

最开始大家都以为是“垃圾”DNA的基因组“暗物质”近年来备受关注,增强子就是其中之一,其中一个很重要的原因就在于科学家们发现如果增强子出错,那么就会导致细胞功能紊乱,引发疾病,毫无疑问这是一个热点,然而这个热点并不好研究,因为调控区域只在特定的细胞中,在特定的情况下才发挥作用,难以定位。

4该区域是否突变在临床上有重要意义

而研究团队的长期目标是了解骨化三醇在炎症性疾病中的作用,基因组的肾脏特异性增强子区域的鉴定已经为骨代谢紊乱的机制提供见解。Meyer和一位旨在了解儿童骨骼疾病的临床医生展开合作,正在检查患者是否在小鼠体内发现的同一增强子区域有突变。

Meyer说:“这样的信息也许能告诉临床医生哪种治疗方法对患者最合适。”因为目前许多骨骼疾病都是用钙和维生素D补充剂治疗的,但是在那些维生素D调节区域有突变的患者实际上可能会受到钙补充的损害。

不过话说回来,奇景出自陡途,不容易取得的目标才能实现所想所愿。来自加州大学旧金山分校的一组研究人员修改了现有的基因编辑CRISPR技术,用以来寻找增强子,他们的方法并不是编辑增强子,令其发挥作用,而是利用一种称为CRISPRa的工具,搜寻影响T细胞免疫细胞发育的一种基因的增强子。这项研究发现将有助于解析自身免疫疾病,如炎性肠病和克罗恩病的病理机制。

这一研究成果公布在8月30日的Nature杂志上,由加州大学旧金山分校的Alexander Marson博士,以及加州大学伯克利分校的Jacob Corn博士这两位助理教授领导完成。这两位科研人员是随着CRISPR技术共同成长的一批科学家,他们曾参与发表了多项CRISPR重要研究,比如Alexander Marson曾领导完成设计出了一种基于基因组编辑系统CRISPR/Cas9的新策略来精确改造人类T细胞,为开展T细胞功能研究提供了一个万能的新工具;Jacob Corn对CRISPR-Cas9技术做出重大改进,在用一段短DNA片段替代另一段DNA时获得了高达60%的前所未有的成功率。

对于最新这项成果,Corn表示,“我们不仅可以找到这些调控区域,而且这种操作快速轻松。此前几年间也才找到一个,而现在只需要几个月就能找到几个了。”

CRISPRa寻找增强子

CRISPR的出现帮助研究人员在理解蛋白编码基因方面取得了快速进展。最常用的CRISPR应用就是利用Cas9酶根据“导向RNA”指向的特殊序列剪切DNA,利用这一技术,科学家可以对任何基因进行切割或编辑,并观察这些变化如何影响细胞或整个生物体。

但是直接编码蛋白质的序列其实只占我们基因组的2%。其余98%的基因组区域属于增强子,还有其它的调控DNA元件,这些不容易究,但又与大量遗传疾病有关。科学家可以根据这些元件如何与结合DNA的蛋白相互作用来寻找潜在的增强子序列,然而要弄清楚哪些增强子作用于哪些基因,可以说是难上加难,一般简单地用CRISPR-Cas9切除增强子并没有太大帮助,因为如果这个增强子在这个实验中使用的特殊细胞类型中不发挥作用,那么就不会有明显的效果。

如果我们将人体基因组看作是一个样板房,那么就会有22,000个灯泡,逐一分析每个开关对应于哪些灯泡,何时打开和关闭,可谓是一个浩瀚工程。

之前的CRISPR研究就是用于切断电线,寻找那些会导致灯泡变暗的电线,从而了解了电路部分。但是,关闭切断一个开关并不能说明具体的情况,因此要想灯泡的开关,还是需要模拟激活增强子的化学信号线索。

利用最新的这一技术,“你可以快速地找到一个增强子,”文章第一作者之一,博士后Benjamin Gowen说。

更好的办法就是找到一个可以靶向基因组任何部分的通用“开关”,比如增强区域。这项研究就找到了——CRISPRa采用的是“减弱版”Cas9酶,虽然CRISPRa也可以通过导向RNA来靶向基因组中的精确位置,但是却不会切割DNA,而是激活该区域中的任何增强子。

CRISPRa的第一个应用是通过单个导向RNA来寻找启动子,也就是基因附近帮助基因启动的作用元件,而通过最新这项研究,科学家们意识到CRISPRa也可以帮助他们寻找增强子,他们推测,通过将CRISPRa复合物靶向数千个不同的潜在增强子位点,即使增强子隔得十万八千里,也可以确定是哪个增强子开启了某个特定的基因。

加州大学旧金山分校的Dimitre Simeonov说:“这是从原理上来说,截然不同分析非编码调控序列的新方法。”

一次进行20,000个实验

研究小组选取的蛋白是IL2RA,这是一种对于T细胞免疫系统功能至关重要的作用因子。在我们人体内,T细胞能根据具体的情况,触发炎症或抑制炎症。IL2RA基因的作用就是编码蛋白,告诉T细胞是不是到时间戴上抗炎的“帽子”了,如果启动这个基因的增强子出错,那么细胞就不能抑制炎症,可能导致自身免疫性疾病如克罗恩病。

为了追踪控制IL2RA的增强子的位置,研究人员构建了20,000多种不同的导向RNA,然后将其放到带有一个修饰后Cas9蛋白的T细胞中。

“为了能找到开启这一基因的序列,我们可以说就是平行进行了20,000次实验”,Marson说。

结果他们发现靶向CRISPRa的一些序列增加了IL2RA的表达,找到了对于调节T细胞命运具有重要意义的位点列表。“每当你有机会用全新的方式提出问题时,都会突然发现用旧方法的遗漏之处,”Gowen说。

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在炎症疾病中利用突变增强子

研究人员发现其中一个增强子序列涉及能增加IBD风险的一个常见遗传变异,不过其作用机制尚不清楚。Marson和Corn等人希望能了解这种遗传突变是否会改变T细胞中调控IL2RA蛋白表达量的开关键,为此他们改变了小鼠T细胞,让其包含有与人类疾病相关的遗传变异,结果发现这些T细胞确实产生较少的IL2RA。

“这走出了解锁免疫细胞调节的基本机制的第一步,大大增加了我们对疾病的认识,”Marson说。

接下来,研究人员还希望扩大该方法,一次性搜索许多不同基因的增强子,从而更快地找到免疫疾病的调节因子。他们希望这一方法能成为一种广泛适用的工具,用于解决各种细胞中的遗传相互作用。

“我们相信这将是一个非常普遍有用的方法,”Corn说,“对神经元或任何其他细胞类型感兴趣的人都很容易上手,寻找与编程这些细胞行为有关的增强子。”

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